一、服务概述
        Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，其中II型CRISPR/Cas免疫系统依赖Cas9内切酶家族能够靶向和剪切外源DNA，是目前使用最广泛的CRISPR/Cas9系统。
        相对ZNF&TALEN编辑技术，作为第三代基因编辑技术——CRISPR/Cas9系统具有显著优势。首先，载体构建简单且靶向效率高，只需要构建20碱基的CRISPR gRNA即可与DNA序列进行匹配，从而介导Cas9蛋白对DNA序列进行切割；其次，CRISPR-Cas9可编辑的位点分布频率较高，易选择合适的位点进行基因编辑；最重要的是，CRISPR-Cas9可同时对基因组进行多位点编辑。CRISPR/Cas9系统因其系统成分简单、操作方便、突变效率高、成本低廉的优点，已成为现在发展最为迅速、国内外学者广泛研究开发、应用于多种生物体基因组的定向基因编辑技术。
        CRISPR/Cas9技术主要由两个组成部分：内切核酸酶蛋白（endonuclease）和一段引导RNA（guide RNA，gRNA）。内切核酸酶是来源于化脓性链球菌的Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割双链DNA的两个DNA切割结构域（RuvC1和HNH样核酸酶结构域），能够使DNA双链断裂。gRNA是改造后的单链嵌合RNA，将细菌tracrRNA的支架功能与细菌crRNA的特异性相结合。gRNA 5'末端的最后20bp作为靶向序列，通过RNA-DNA碱基配对将Cas9 / gRNA复合物特异性结合至基因组DNA靶点，位于基因组DNA间隔区相邻基序（PAM）的上游（图1）。

图1 CRISPR/Cas9基因敲除示意图

        不同菌株类型的CRISPR/Cas蛋白识别的PAM序列有所区别，化脓性链球菌Cas9的序列是5'-NGG。因此，我们所用的经过改造的CRISPR/Cas9系统，可以针对任何5'-N20-NGG DNA序列并产生精确的双链断裂。然后通过细胞生物学中通用的DNA修复机制——非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR），来修复双链断裂的基因组DNA（图2）。在修复过程中会产生一定数目的碱基缺失突变或碱基插入突变，而这些插入和缺失会造成基因的外显子阅读框的移码或提前引入终止密码子，导致无法转录为正确mRNA，沉默gRNA结合的靶基因。

图2 CRISPR/Cas9系统沉默靶基因机制示意图

 
二、服务内容
1. 设计gRNA靶向序列。
2. 构建含有gRNA的CRISPR/Cas9敲除质粒，测序验证产物。
3. 利用构建完成的CRISPR/Cas9敲除质粒，包装慢病毒并测定滴度。
4. 筛选获得的基因敲除细胞株进行T7E1验证。
5. 基因敲除细胞单克隆化，扩大培养后进行测序鉴定相应克隆，确认存在双等位基因敲除。
6. 基因敲除细胞Western检测验证。
 
三、技术优势
1. 技术新：基于最新的CRISPR/Cas9技术，有效敲除目的基因并避免脱靶效应。
2. 标准严：可以提供经过T7E1法验证的慢病毒或细胞株，也可以提供经过Western blot验证的多克隆细胞株。
3. 筛选快：基于CRISPR/Cas9技术的sgRNA快速筛选和验证体系，可以在最短的时间内完成sgRNA的筛选和T7E1法验证。
4. 时间短：目的基因敲除的多克隆细胞株仅需5-6周即可完成；单克隆细胞株一般在9-10周完成。
 
四、服务提供图片（以MSTN基因敲除为例）
（1）gRNA靶向序列位置及相关参数。

图3 MSTN基因gRNA序列（黑体）及PAM序列（下划线）

（2）构建完成的质粒图谱。

图4 质粒构建过程

图5 构建完成的MSTN基因CRISPR/Cas9敲除质粒图谱

（3）筛选细胞株T7E1验证结果
对敲除基因后的细胞的PCR产物进行变性和退火处理后加入T7E1 (核酸内切酶，只切割碱基错配的DNA)，经T7E1消化后可见明显的切割条带，说明预期的敲除位点附近存在大量gRNA引导Cas9切割形成的缺失突变。

图6 MSTN基因敲除细胞株T7E1验证结果

（4）基因敲除细胞单克隆测序验证结果。

图7 MSTN基因敲除细胞株单克隆测序结果。

（5）基因敲除细胞Western检测验证结果
        筛选获得的阳性细胞传代2次后，取细胞制备蛋白样品，每孔的蛋白上样量为20-40μg。用GAPDH作为内参，用抗MSTN的抗体检测细胞中MSTN蛋白表达情况。

图8 MSTN基因敲除细胞中MSTN蛋白Western检测结果

 
五、服务价格及周期

 
六、CRISPR/Cas9技术服务流程
1. 用户下载并填写CRISPR/Cas9技术服务协议书，发送至service@morecell.com.cn。
2.  双方确认并签订技术服务协议书，按照协议内容进行技术服务。
 
七、客户须知
1. 客户提供需要编辑的目的基因相关信息；
2. 客户提供需要编辑的细胞株及其相关信息；
3. 客户需要提供需要编辑目的基因的抗体（如果选做western）；
4. 敲除用慢病毒将以干冰运输的方式提供；
5. 基因敲除的细胞株将以干冰运输或活细胞培养的方式提供。